Ca++Mg++ ——ATP酶測(cè)試盒
測(cè)定方法: 微量法
測(cè)定規(guī)格: 100管/48樣
保存條件: 低溫避光保存
有 效 期: 6個(gè)月
注 意: 正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義:
Ca++ Mg++-ATP酶廣泛分布于植物、動(dòng)物、微生物和細(xì)胞中,可催化ATP水解生成ADP和無(wú)機(jī)磷。
測(cè)定原理:
根據(jù)Ca++ Mg++-ATP酶分解ATP生成ADP及無(wú)機(jī)磷,通過(guò)測(cè)定無(wú)機(jī)磷的量來(lái)確定ATP酶活性高低。
需自備的儀器及用品:
可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
樣品酶液的制備:
1、細(xì)胞或組織樣品的制備:
培養(yǎng)細(xì)胞:先收集或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照或細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬(wàn)或細(xì)胞加入1mL提取液),超聲波破碎或細(xì)胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次);8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。
組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。
2、血清(漿)樣品:直接檢測(cè)。
注意事項(xiàng):
1、由于每一個(gè)樣都必須做對(duì)照,本試劑盒100管只能測(cè) 48份Ca++ Mg++-ATP酶。
2、此法具有微量、靈敏、快速的特點(diǎn)。所以對(duì)測(cè)定所用試管要求嚴(yán)格無(wú)磷。避免磷污染是檢測(cè)成敗的關(guān)鍵。
3、空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只要做一管。
Ca++ Mg++- ATPase活力的計(jì)算:
1、血清(漿)Ca++ Mg++- ATPase活力的計(jì)算:
定義:每小時(shí)每毫升血清(漿)中Ca++ Mg++- ATP 酶分解ATP 產(chǎn)生1μmol無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。
Ca++ Mg++-ATP酶活力(μmol/h/mL)= [C標(biāo)準(zhǔn)管×V總]×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷V樣÷T=7.5×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)
2、組織、或細(xì)胞中Ca++ Mg++- ATPase活力的計(jì)算:
(1)按蛋白濃度計(jì)算:
定義:每小時(shí)每毫克組織蛋白中Ca++ Mg++- ATP 酶分解ATP 產(chǎn)生1μmol無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。
Ca++ Mg++-ATP酶活力(μmol/h / mg prot)= [C標(biāo)準(zhǔn)管×V總]×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷(V樣×Cpr)÷T =7.5×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷Cpr
(2)按樣本鮮重計(jì)算:
定義:每小時(shí)每克組織中Ca++ Mg++-ATP 酶分解ATP 產(chǎn)生1μmol無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。
Ca++ Mg++-ATP酶活力(μmol/h /g 鮮重)=[C標(biāo)準(zhǔn)管×V總]×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷(W× V樣÷V樣總)÷T=7.5×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷W
(3)按或細(xì)胞密度計(jì)算:
定義:每小時(shí)每1萬(wàn)個(gè)或細(xì)胞中Ca++ Mg++-ATP 酶分解ATP 產(chǎn)生1μmol無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。
Ca++ Mg++-ATP酶活力(μmol/h /104 cell)= [C標(biāo)準(zhǔn)管×V總]×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.015×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)
C標(biāo)準(zhǔn)管:標(biāo)準(zhǔn)管濃度,0.5μmol/mL;V總:酶促反應(yīng)總體積,0.25mL;V樣:加入樣本體積,0.1mL ;V樣總:加入提取液體積,1mL;T:反應(yīng)時(shí)間,1/6小時(shí);Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本鮮重,g;500:或細(xì)胞總數(shù),500萬(wàn)。
