線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅴ/ATP合酶/三磷酸腺苷合酶測(cè)試盒
測(cè)定方法: 微量法
測(cè)定規(guī)格: 100管/48樣
保存條件: 低溫避光保存
有 效 期: 6個(gè)月
注 意 : 正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義:
線粒體復(fù)合體Ⅴ又稱F1F0-ATP合酶,廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體中,由F1和F0兩個(gè)亞單位組成。該酶利用呼吸鏈產(chǎn)生的質(zhì)子電化學(xué)梯度催化ATP合成,也可逆過程水解ATP。此外,復(fù)合體Ⅴ還存在于葉綠體、異養(yǎng)菌和光合中。復(fù)合體Ⅴ是線粒體氧化磷酸化和葉綠體光合磷酸化合成ATP的關(guān)鍵酶。
測(cè)定原理:
復(fù)合體Ⅴ水解ATP產(chǎn)生ADP和Pi,通過測(cè)定Pi增加速率來(lái)測(cè)定復(fù)合體Ⅴ活性。
需自備的儀器和用品:
可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
樣本的前處理:
組織、或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:
①準(zhǔn)確稱取0.1g組織或收集500萬(wàn)細(xì)胞,加入1mL試劑一和10uL 試劑三,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
②將勻漿600g,4℃離心5min。
③棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11000g,4℃離心10min。
④上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白,可用于測(cè)定從線粒體泄漏的復(fù)合體Ⅴ(此步可選做)。
⑤步驟④中的沉淀即為線粒體,加入800uL試劑二和8uL 試劑三,超聲波破碎(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10秒,重復(fù)30次),用于復(fù)合體Ⅴ酶活性測(cè)定。
